雨生红球藻的培养基配置、接种、生长检测及诱导虾青素

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来源:虾青素品牌网 2019-07-14

培养基是为雨生红球藻细胞繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等,本试验中为细胞生长提供氮源和磷源的物质分别是KNO3和K2HPO4,碳源由通用入的空气提供;细胞培养所需的的培养基pH必须控制在一定的范围内,使得细胞的生长繁殖或代谢产物的产生不受影响,在本试验中,雨生红球藻的最适pH为6.8-7.0,培养初期pH约为7.0;试验过程中为简化操作流程可以将试剂按一定比例配成母液,现用现取,本试验的母液比例为1:1000;本试验中由于实验室VB12的缺乏且含量很少,可不添加。雨生红球藻的培养基配方如表1所示。

用电子天平精确称量培养基的各个组分试剂,在小烧杯中完全溶解并降到室温后,用容量瓶定容至100 mL,然后分装到200 mL或250 mL锥形瓶中,用二到三层报纸包扎封口。溶解过程中对于难以溶解的物质如FeSO4•7H2O,可以放到二列四孔型电热恒温水浴锅中加热溶解。

■试验材料的灭菌

将分装好的盛有母液的锥形瓶置于立式压力蒸汽灭菌器中进行高压蒸汽灭菌,条件为121℃,30 min。注意对于高温易分解的物质如VB1和NaHCO3,不能进行高温灭菌,可以在配制培养基前放在超净工作台中紫外灭菌20 min。为简化试验操作流程,培养基组分灭菌时可以将后期需要灭菌的试验材料一并灭菌,如培养基配制时所需要的无菌水(本次试验共用2×1700 mL自来水,装入2000 mL的锥形瓶中,四层报纸包扎封口)和移液枪枪头,雨生红球藻培养时通气所需要的橡胶管等。灭菌后的培养基组分母液可以在本次试验中多次使用,在配制培养基时,可以根据比例吸取母液。

表1  雨生红球藻培养基配方

Table 1  The components of culture media for Haematococcus pluvialis

■接种

本试验用2000 mL锥形瓶作为雨生红球藻扩大化培养的反应容器,共需要扩培2瓶。为防止在通气过程中培养液溅出,每瓶培养基体积应控制在2000 mL以下,所以每瓶的培养基体积定为1700 mL。

本试验的接种方式为湿藻接种,即将含有旧液的雨生红球藻藻种直接接种于新鲜的培养基中,虽然有文献记录干藻接种(先将藻种液离心,弃旧藻液,再将藻种接种于新鲜的培养基中)较湿藻接种更利于雨生红球藻的生长 [32] ,但湿藻接种较干藻接种更方便快捷,因此在实验室中应用更广。

确定好培养基体积和接种方式后,最后确定藻种的接种量。本试验的接种量定义为移入藻种液的体积和原培养基体积的比例。接种量的大小决定于雨生红球藻在反应器中生长繁殖的速度,采用较大的接种量可以缩短反应器中雨生红球藻达到高峰的时间,使虾青素提前积累,并可减少杂藻的生长机会。但接种量过大或者过小,均会影响雨生红球藻的生长,过大会引起溶氧不足,过小会延长培养时间。根据经验显示,雨生红球藻培养时的接种量为10%~20%,本试验的接种量为15%,即向新鲜的培养基中直接倒入250 mL绿色游动藻种。

接种前要对藻种进行镜检,确定藻细胞处于绿色游动时期,该时期的藻细胞活动性强,生长旺盛,接种到新鲜培养基后能较快的适应新环境,利于藻细胞的存活。接种前一天要将保存在冰箱中的雨生红球藻藻种取出,放于室温下静置活化。培养基的配制和藻细胞的接种都要在超净工作台中进行,并且接种前各种接种工具和接种材料都要进行紫外灭菌20 min,整个操作过程要严格按照无菌操作要求进行,防止杂藻和杂菌的污染。 

■培养

接种后就可以进行雨生红球藻的扩大化培养了,本试验采用的培养方式是通气细胞悬浮培养。培养的第一天不通气,不提供额外的光照,给雨生红球藻一定的时间以适应新的生长环境,培养的第二天向锥形瓶中通入空气。通气前用高压蒸汽灭菌过的移液枪枪头在锥形瓶的封口报纸上扎一个大小合适的孔洞,使通气用的橡胶管刚好通过孔洞插入锥形瓶中。如果孔洞太大可以在橡胶管与报纸间塞入适量的棉花(提前进行紫外灭菌)以阻止灰尘进入锥形瓶中,防止杂菌的污染,各项装置组装完毕后可以接通吹气泵的电源进行通气。需要注意的是,此时要控制空气的通入量,资料显示 (1.1.4 环境条件对雨生红球藻生长的影响 (4)溶解氧),较低的溶解氧(如50%饱和度)溶解氧有利于雨生红球藻的自养生长,因此培养初期过大的通气量不利于藻细胞进行自养生长,以锥形瓶中的空气气泡按每秒冒出一到两个为宜。培养三到四天后可以加大空气的通入量,以锥形瓶中的空气气泡呈连续线状且瓶中的藻悬液液体整体呈翻动状态为宜,此时的通气量如果过小,锥形瓶中的雨生红球藻容易聚集成团,沉降到瓶的底部,导致光照强度不均一,影响雨生红球藻的生长,而且成团的藻细胞不容易被摇散开,不利于藻细胞的计数和OD值的测量。相反,通气量如果过大,藻悬液容易被吹溅到锥形瓶瓶口,造成培养液的污染。

资料显示,最适宜雨生红球藻生长的光照强度数值大约为30μE/(㎡•s)。在30μE/(㎡•s)的光照条件下,持续光照与12 h光暗交替没有显著的差异,在小于20μE/(㎡•s)的光照条件下持续光照反而有利于细胞的生长。光质方面红光比蓝光对雨生红球藻的生长更为有利。

从雨生红球藻细胞生长的最适光强的角度出发并结合现有的实验室设备条件,确定本次试验的培养的光照强度为1000~1500 lx(已知1μE/(㎡•s) ≈50 lx),光照周期为连续光照,光照仪器选用GBR-3型光生物反应器,光质为白光,光照为单侧光。培养装置如图2所示。随着培养的进行,锥形瓶中的藻细胞数量会不断增多,藻细胞密度会不断增大,锥形瓶内的实际光照强度会不断小于预设光照强度,又由于本次试验采用单侧光照,锥形瓶内不同位置的光照强度差别较大。所以,在培养过程中要及时测量锥形瓶外的光照强度,并以此估计瓶内的光照强度,通过靠近或远离LED灯来增大或减小光照强度。估计锥形瓶中的光照强度可以用以下方法:用JD-3型光强计测量瓶外某一处的面向光源的光照强度,然后再测量一下该处延锥形瓶瓶身的另一处的光照强度,两处光照强度的平均值即为瓶内的近似光照强度。 

虽然资料显示最适于雨生红球藻光合自养生长的温度为25℃~28℃,但由于实验室试验仪器有限,无法对培养温度进行控制,故本次试验的培养温度为室温,培养温度为10±1℃,培养时间为25天。

图2 雨生红球藻培养时期装置图

Fig 2 Apparatus during the period of Haematococcus pluvialis culture

■生长检测

藻细胞在培养的过程中要对培养液的各项参数进行检测并记录结果,检测内容包括细胞形态、细胞密度、培养物的吸光度和pH值。

通过细胞形态的观察可以判断出雨生红球藻处于生活周期的何种时期,确定诱导雨生红球藻积累虾青素的最佳时期,同时还可以观察培养物中是否染杂菌。

细胞密度的测定在实际生产中是必不可少的,以时间为横轴以对应的细胞密度为纵轴制作出来的细胞生长曲线对生产有重要的指导意义。从该曲线中可以找出细胞生长的对数生长期,再结合对数生长期的OD值,以细胞密度为横坐标以对应的OD值为纵坐标,绘制细胞密度和OD值关系曲线。在实验室和生产中取样计算细胞培养物生物量时,只需测定培养物的OD值,通过该关系曲线计算对应的细胞密度,由此根据普通微生物学通用的公式计算细胞的生长速率μ=(㏑Nt-㏑N0)/t ,其中Nt为t时间的细胞数,N0为初始细胞数,t为培养时间 [33] 。

(1) 细胞形态观察

在培养的过程中,不定期的从培养物中取少量的藻悬液滴加到干净的载玻片上,在显微镜下进行镜检,观察培养物中是否有杂菌或杂藻污染。前面也提到过(详见1.1.2  雨生红球藻的生活周期和1.2.2 雨生红球藻细胞内虾青素的合成及积累),在雨生红球藻生活周期的后期,当细胞停止分裂时,藻细胞就会变大,细胞壁变厚,虾青素的合成速率大于分解速率,虾青素开始积累。当培养物中的大部分细胞呈现为不游动状态时,是诱导虾青素的最好时期。

(2) 培养物细胞密度的测定

由于雨生红球藻细胞体积较大,故测定细胞密度时通常采用显微镜直接计数法-血球板计数法 [34] 。

雨生红球藻在生长初期细胞游动性较强,计数时会造成很大的误差,对此可以先将藻细胞用卢戈氏液杀死再进行计数。卢戈氏固定液配制方法 [35] :称取10g碘化钾(KI),溶于少量的水中(10~20 mL),待其完全溶解后,加入5g碘(I2)充分摇动,待碘完全溶解后定容到100mL即配成卢戈氏液,最后装入棕色试剂瓶中保存。卢戈氏液最好现配现用,如果要长期使用,需要加入5 mL甲醛。取用时1 mL藻细胞悬液加10μL卢戈氏固定液,静置1 min后再进行血球板计数。

本试验采用的是25×16型的血球计数板,在每天的15:00~16:00之间用10×40倍镜对培养物的藻细胞密度进行计数并记录结果。注意计数前要将培养物充分摇匀再取样,以减少误差,每次计数时都测定2~3次,最终的细胞密度取多次测定后的平均细胞密度,以减少测定误差。

(3) 培养物吸光度值(OD值)的测定

相关资料显示 [33] ,雨生红球藻在560 nm处有最大吸收峰,该吸收峰是雨生红球藻细胞中叶绿体的特征吸收峰。所以本试验用722型光栅分光光度计在560 nm波长下测定培养液的吸光度值(OD值)。为减少系统误差每次测定时需要重复测定1~2次,取平均值作为当次测定的结果并记录该数值。注意测量前同样要将培养物充分摇匀,减少系统误差。

(4) 培养物pH的测定

每天用pH试纸测定培养物的pH值,并记录结果。

■诱导虾青素

培养25天(从2014年2月26日到2014年3月22日共计25天)后,藻细胞密度已经到达4.0×104个/mL,并且细胞密度和吸光度值较前两天基本保持不变,镜检结果也显示培养物中游动的藻细胞数量已经很少,大部分的细胞呈静止状态,细胞体积变大,细胞壁明显变厚,少量的细胞内部甚至已经出现红色的虾青素颗粒。此时改变培养基的配方,在高光强下诱导虾青素,初步探讨单因素条件对虾青素积累量的影响。多项研究资料表明,氮饥饿、磷饥饿和盐胁迫都有利于雨生红球藻大量积累虾青素,而高强度的光照又是雨生红球藻积累虾青素的必要条件。

将高密度的藻液9000 r/min离心10 min使藻细胞沉淀,去上清液,收集藻种,加入一定量的无菌水形成粘稠状的藻液,再平均分配到用于诱导的锥形瓶中,用四层报纸封口包扎封口,置于10000~20000 lx光强下诱导雨生红球藻积累虾青素,诱导时间为20天(从2014年3月25日到4月13日共计20天),每间隔2~3天对诱导物进行镜检和计数。

由于诱导虾青素的过程也要避免染杂菌和杂藻,因此离心和重接种过程也要保持无菌环境。要求离心前将规格为80 mL的离心管放在紫外灯下灭菌20 min,离心后取藻种时用无菌水进行冲洗,重接种要在超净工作台中进行。

本试验共设置4组培养基,每组2个平行,其中第1组为全营养培养基,第2组为缺氮培养基(培养基不加KNO3),第3组为缺磷培养基(培养基不加K2HPO4),第4组为盐胁迫培养基(培养基中加入NaCl,浓度达到0.8%)。每瓶锥形瓶中的培养基体积为500 mL。

■参考文献

[32] 张涛. 雨生红球藻培养条件探索[D]. 烟台:烟台大学生命科学学院生物技术实验室, 2006:6-7.

[33] 欧阳琴. 雨生红球藻的培养及其虾青素提取 [D]. 福建: 福州大学侨兴轻工学院, 2004:24-25.

[34] 沈萍,陈向东等.微生物学实验(第4版)[M].北京: 高等教育出版社, 2000: 52-53.

[35] SC/T 9402-2010. 淡水浮游生物调查技术规范 [S].

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