雨生红球藻虾青素含暈测定方法的探讨

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来源:虾青素品牌网 2019-08-27

雨生红球藻是一种单细胞微藻,隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属。由于该藻能大量累积虾青素而呈现红色,故取名红球藻。雨生红球藻是自然界天然虾青素含量最高的生物,含量达到干细胞的2%-4%,因此通过培养雨生红球藻生产虾青素长期以来一直是藻类研究的一个热点。

目前实验室的虾青素测定方法很多,提取时间、提取溶剂、测定方法等都有所不同,而各生产虾青素公司也有不同的测定方法。目前采用的虾青素测定方法主要有高效液相色谱测定法(HPLC)和分光光度测定法。

1.实验材料与方法

(1)实验材料:藻粉为 Cyanotech公司购买的雨生红球藻粉。

(2)仪器与设备:UV-7504紫外可见分光光度计;TP300超声波清洗仪;TD180-2B型离心机;XW-80A涡旋搅拌器;高效液相色谱仪。

(3)方法:所有藻粉均加液氮后用研钵研磨5min进行细胞破壁。

①某天然虾青素有限公司的方法

实验方法:精确称取藻粉20mg,置于10ml玻璃离心管,加入5ml含5%NaOH、30%甲醇的水溶液,70℃水浴5min,保温过程中经常摇动。3000rpm离心3min,然后去上清液(叶绿素被抽提到上清液中,并被强碱破坏),藻渣备用。

离心管中加入3ml含有少量醋酸(5滴10ml)的DMSO(二甲基亚砜),摇匀,70℃保温5min,保温过程中要不断摇动离心管。3000rpmm离3min,将上清液移入10ml容量瓶,重复至少3次,使剩余离心管底部的藻渣无颜色或很浅的颜色。

将1次或几次收集的上清液用DMSO精确定容至10ml,取1ml放入另1个10ml容量瓶中,用DMSO精确定容至10ml。

将待测溶液放入1cm光径比色皿中,在492nm波长下测定吸光值A,DMSO作空白对照。

计算公式:溶液中虾青素的浓度(mg/ml):

藻粉中虾青素的含量

C2=(C1×100/20)×100%

②美国 Cyanotech公司的测定方法

实验方法:称取25mg千燥藻粉,放入10ml离心管中,加3g石英砂。在离心管中加入5 mI DMSO,45-50℃水浴30min,每10min涡旋振荡15s(共计3次)。3000rpm离心5min使细胞物质沉淀,将上清液转入25m容量瓶中。再往离心管中加入5m丙酮,涡旋振荡30s,3000rpm离心5min使细胞物质沉淀,将上清液转入25ml容量瓶中,丙酮抽提至少3次,直至上清液基本无色(吸光值小于0.05)。

用丙酮定容至25m,盖上容量瓶,轻微振荡混合,吸取5~7m放入离心管,再次3000rpm离心以除去前面步骤中带入的颗粒物.在474nm波长下测定最大吸光值,丙酮作空白对照。如果吸光值大于1.25,则必须对样品用丙酮稀释后再测,稀释倍数一般为1:7。

计算公式:

虾青素含量C(mg/ml)=吸光值A/消光系数a

虾青素含量(%)=C×10ml/10mg×5×100%

③氯仿-乙醇混合溶液提取方法

实验方法:取10mg干燥的藻粉,加入到10ml离心管中,再在离心管中加入5m的5%KOH、30%甲醇的混合溶液,50℃下处理15min,以去除叶绿素。用蒸馏水洗2次,3000rpm离心,然后去除上清液。在去除上清液后的藻渣中加5ml氯仿:乙醇(v/v=1:1)的混合溶液,40℃下水溶45min,保温过程中要经常振荡。然后3000rmp离心5min,取上清液。再用氯仿:乙醇的混合溶液定容至10m容量瓶中。轻微振荡混匀,再在487nm下测定最大吸光值。如果吸光值过高,可适当稀释5倍后再测。

④高效液相色谱分析测定

Nova-Pak C18色谱柱;流动相A为水流动相B为甲醇;洗脱梯度:10%A,90%B(0min);10%A,90%B(1min);0%A,100%B(10min);0%A,100%B(20min)。流速1ml/min;检测器为 Waters 996光电二极管阵列检测器;光谱扫描波长范围300~700mm,检测波长为476mm;进样量为10ul。检测波长的选择:雨生红球藻中含有多种色素,其各种组分的吸收峰在300-670mm之间,游离虾青素和虾青素酯的吸收峰在470~480mm之间,因此分析选用检测波长为476mm。

用外标峰面积法测定线性关系:准确吸取一定体积的虾青素标准储备液,配制成6份质量浓度不同的标准样品,分别取10μl进样。由色谱工作占处理数据,以虾青素质量浓度为横坐标,相应峰面积为纵坐标,绘制虾青素含量的标准曲线。

精密度实验:将一标准溶液平行测定6次,计算各组分的峰面积和保留时间的相对标准偏差。

雨生红球藻中虾青素的提取:取10mg藻粉,加液氮后用研钵研磨5min进行细胞破壁,加入3ml丙酮,涡旋震荡15s,置50℃水浴30min每隔10min震荡15s,3500rpm离心10min,取上清液,再加入2ml丙酮涡旋震荡15s后再次离心,重复以上操作直到藻体变白色。将虾青索丙酮提取液用氮气吹干,用25ml甲醇定容后贮存于-20℃冰箱备用。

2.结果与讨论

(1)HPLC分析方法的建立:用外标峰面积法测定结果,标准虾青素HPLC图谱如图18所示,实验样品提取得到的虾青素的HPLC图谱如图所示。

由色谱工作站处理数据,以虾青素的质量浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,得到虾青素的标准曲线,如图20所示。

y=32202x+12112R2=0.99,以标准品的峰高等于2倍基线噪音时虾青素的量作为检出限,则虾青素的检出限为0.045ug•ml-1。

精密度实验结果:将一标准溶液平行测定6次,计算各组分的峰面积、保留时间及它们的相对标准偏差,结果见表3。

(2)分光光度法与HPLC方法的参数比较:从提取试剂、破壁方法、测定波长和摩尔吸光系数4个方面进行方法的参数比较,见表4。可看出:提取试剂都不同,测定波长略有差别。

(3)红球藻虾青素含量实测结果比较:表5是采用4种方法得到的最虾青素的百分含量,可以看出,如果以HPLC定量分析的虾青素含量作为标准参照,采用某虾青素公司的分析方法得到的含量值为HPLC法的89%,而其他2种方法约为HPLC法的80%。

 (4)讨论:从表5中可以看到,在3种分光光度法中,某虾青素公司的方法得到的虾青素含量比其他2种要高,达到HPLC测得的89.2%,其他2种分别只达到了76.3%和80.4%,造成测定的虾青素含量差异的原因:

①提取溶剂:溶剂的选择对于虾青素的提取是非常重要的。苯和氯仿等大多数有机物,被誉为“万能溶剂”,广泛用作溶剂和反应试剂。醋酸能迅速渗人细胞组织,会使组织膨胀,有助于二甲基亚砜的渗入,因此能有效提取虾青素。

某虾青素公司采用的是先用二甲基桠枫后丙酮提取,丙酮是许多物质的良好溶剂。丙酮的极性较高,虾青素的溶解度虽然较差,但是由于是亲水性溶剂,易于渗透进入细胞中,加上配合二甲基亚砜提取,有较高的提取效率。采用的氯仿-乙醇混合溶液提取方法是用1:1的氯仿和乙醇混合试剂提取。但没有进行二甲基桠枫的测试,因此和上述2种方法没有进行直接的比较。

由于氯仿等溶剂亲水性很差,溶剂不容易进入细胞中,因此提取率不高。而丙酮的极性较高,属亲水性溶剂,易于渗透进入细胞中,因此提取率比氯仿高。而二甲基桠枫属于高极性溶剂,虾青素溶解度小,但属于亲水性溶剂,提取率还可以,但在本次实验中采用二甲基桠枫提取得到的虾青素含量最低,证明其实际提取能力弱于丙酮和氯仿。

②有机溶剂:各种有机溶剂从雨生红球藻细胞萃取虾青素的原理是溶剂通过细胞壁进入细胞,使得色素溶解在有机溶剂中从而通过扩散作用进入溶液,这是一种固一液萃取过程。含有很高的虾青素的藻细胞的细胞壁很厚,在没破壁或破壁不完全的条件下虾青素很难提取出来,因此在提取前必须进行破壁处理,且破壁效果的好坏对于提取虾青素的效果有着直接的影响。

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